A enzima quitinase de Moniliophthora perniciosa, o fungo causador da doença vassoura de bruxa em Theobroma cacao, foi parcialmente purificada por precipitação com sulfato de amônio e filtração em coluna de Sephacryl S-200 usando fosfato de sódio como tampão de extração. A metodologia de Superfície de resposta (MSR) foi usada para determinar o pH e temperatura ótimos. Foram isoladas quatro quitinases diferentes: ChitMp I, ChitMp II, ChitMp III e ChitMp IV. A ChitMp I mostrou temperatura ótima de 44-73ºC e pH ótimo de 7,0-8,4. A ChitMp II apresentou temperatura ótima entre 45-73ºC e pH ótimo de 7,0-8,4. ChitMp III apresentou temperatura ótima de 54-67ºC e pH ótimo de 7,3-8,8. ChitMp IV apresentou temperatura ótima de 60ºC e pH ótimo em 7,0. Em relação à biologia computacional a sequência primária foi feita in silico usando banco de dados do Projeto Genoma/Proteoma do M. perniciosa, obtendo-se uma sequência com 564 pb e 188 aminoácidos, que foi utilizada para a obtenção da estrutura tridimensional por metodologia de modelagem comparativa. Os modelos gerados foram submetidos à validação usando Procheck 3.0 and ANOLEA. O modelo proposto para a quitinase foi submetido à análise dinâmica por 1 ns, resultando em um modelo com 91,7% de seus resíduos em locais regiões favoráveis no gráfico de Ramachandran e RMS de 2,68.

The enzyme chitinase from Moniliophthora perniciosa the causative agent of the witches' broom disease in Theobroma cacao, was partially purified with ammonium sulfate and filtration by Sephacryl S-200 using sodium phosphate as an extraction buffer. Response surface methodology (RSM) was used to determine the optimum pH and temperature conditions. Four different isoenzymes were obtained: ChitMp I, ChitMp II, ChitMp III and ChitMp IV. ChitMp I had an optimum temperature at 44-73ºC and an optimum pH at 7.0-8.4. ChitMp II had an optimum temperature at 45-73ºC and an optimum pH at 7.0-8.4. ChitMp III had an optimum temperature at 54-67ºC and an optimum pH at 7.3-8.8. ChitMp IV had an optimum temperature at 60ºC and an optimum pH at 7.0. For the computational biology, the primary sequence was determined in silico from the database of the Genome/Proteome Project of M. perniciosa, yielding a sequence with 564 bp and 188 amino acids that was used for the three-dimensional design in a comparative modeling methodology. The generated models were submitted to validation using Procheck 3.0 and ANOLEA. The model proposed for the chitinase was subjected to a dynamic analysis over a 1 ns interval, resulting in a model with 91.7% of the residues occupying favorable places on the Ramachandran plot and an RMS of 2.68.

A enzima glucanase de Moniliophthora perniciosa foi produzida em meio líquido e purificada a partir do sobrenadante da cultura. A metodologia de superfície de resposta (MSR) foi usada para avaliar os efeitos das variáveis, incluindo indutor (extrato de levedura) e tempo de fermentação, na atividade da glucanase de M. perniciosa detectada no meio de cultura. A enzima presente no sobrenadante foi purificada em duas etapas: precipitação com sulfato de amônio (70%) e cromatografia de filtração em gel em Sephacryl S-200. A produção da enzima glucanase foi maior na concentração de 5,9 g L-1 de extrato de levedura e 13 dias de fermentação. Os resultados mostraram três diferentes isoformas (GLUI, GLUII e GLUIII) com fatores de purificação de 4,33, 1,86 e 3,03, respectivamente. O extrato enzimático parcialmente purificado mostrou um pH ótimo de 5,0 e uma temperatura ótima de 40°C. A atividade enzimática aumentou na presença de KCl em todas as concentrações estudadas. A atividade da glucanase foi maior na presença de NaCl 0,2 M. A enzima apresentou alta estabilidade térmica, perdendo apenas 10,20% de sua atividade específica após 40 minutos de incubação a 90°C. Os resultados de termoestabilidade e a atividade em baixo pH mostraram que a enzima glucanase de M. perniciosa tem características promissoras para futuras aplicações industriais.

The enzyme glucanase from Moniliophthora perniciosa was produced in liquid medium and purified from the culture supernatant. A multivariate statistical approach (Response Surface Methodology - RSM) was employed to evaluate the effect of variables, including inducer (yeast extract) and fermentation time, on secreted glucanase activities M. perniciosa detected in the culture medium. The crude enzyme present in the supernatant was purified in two steps: precipitation with ammonium sulfate (70%) and gel filtration chromatography on Sephacryl S-200. The best inducer and fermentation time for glucanase activities were 5.9 g L-1 and 13 days, respectively. The results revealed three different isoforms (GLUI, GLUII and GLUIII) with purification factors of 4.33, 1.86 and 3.03, respectively. The partially purified enzymatic extract showed an optimum pH of 5.0 and an optimum temperature of 40°C. The enzymatic activity increased in the presence of KCl at all concentrations studied. The glucanase activity was highest in the presence of 0.2 M NaCl. The enzyme showed high thermal stability, losing only 10.20% of its specific activity after 40 minutes of incubation at 90°C. A purified enzyme with relatively good thermostability that is stable at low pH might be used in future industrial applications.

A mancha foliar bacteriana do eucalipto caracteriza-se inicialmente por lesões encharcadas do tipo anasarca, internervurais, angulares e anfígenas, concentradas ao longo da nervura principal, nas margens da folha ou distribuídas aleatoriamente sobre o limbo. Com o progresso da doença, as lesões adquirem aspecto ressecado e coloração marrom a palha, podendo conter orifícios no centro da lesão ou áreas recortadas do limbo em conseqüência do aborto da área necrosada, principalmente em folhas mais jovens. Eventualmente pode haver necrose em pecíolo e ramos. A doença culmina com a desfolha devido à senescência precoce das folhas infectadas. O diagnóstico inequívoco é realizado por meio de exsudação de pus bacteriano a partir de fragmento de folha infectada, sob microscópio óptico de luz (200 x). Vinte e cinco isolados oriundos dos estados do Amapá (2), Bahia (4), Minas Gerais (2), São Paulo (9), Pará (3), Mato Grosso do Sul (1) e Rio Grande do Sul (4) indutores de reação de hipersensibilidade em plantas não-hospedeiras e, patogênicos ao eucalipto em testes de injeção de suspensão bacteriana no mesófilo foliar, foram identificados por meio de testes bioquímicos, utilização de fontes de carbono e seqüenciamento do rDNA16S. Dez foram identificados como Xanthomonas axonopodis, quatro como X. campestris, quatro como Pseudomonas syringae, dois como P. cichorii, dois como P. putida, um como Erwinia sp. e dois foram similares a gêneros da família Rhizobiaceae. Nos testes de inoculação por atomização de suspensão bacteriana, apenas isolados de P. cichorii, X. axonopodis e os similares a membros da família Rhizobiaceae foram patogênicos a eucalipto. X. axonopodis é provavelmente o agente etiológico predominante da mancha foliar bacteriana de Eucalyptus spp., no Brasil.

Bacterial leaf blight of eucalyptus is initially characterized by water soaked, angular, amphigenous and interveinal lesions, concentrated along the main vein, at the edges or scattered on the leaf blade. As the disease progresses, the lesions become brown to pale, and when young leaves are infected leaf cut areas at the edges or perforations at the center of the lesions may appear due to abortion of the necrotic area. Eventually, necrosis may be found on petiole and twigs. Leaf fall commonly occurs on highly susceptible genotypes due to the early senescence of diseased leaves. Precise diagnosis is accomplished by bacterial exudation from leaf sections placed in a water drop under light microscope (200 x). Twenty-five bacterial isolates from Amapá (2), Bahia (4), Minas Gerais (2), São Paulo (9), Pará (3), Mato Grosso do Sul (1), and Rio Grande do Sul (4) States, which induced hypersensitive reaction (HR) in non-host plants and were pathogenic to eucalyptus, when inoculated by inoculum injection, were identified by biochemical assays, using carbon sources (MicroLogTM BIOLOG) and sequence analysis (16S rDNA). Ten isolates were identified as Xanthomonas axonopodis, four as X. campestris, four as Pseudomonas syringae, two as P. putida, two as P. cichorii, one as Erwinia sp., and two were similar to bacterial genera of Rhizobiaceae. When spray inoculated on intact plants of eucalyptus, only X. axonopodis, P. cichorii and isolates of the Rhizobiaceae family induced typical symptoms of the disease and were considered pathogenic. In Brazil, X. axonopodis seems to be the most widespread species causing the bacterial leaf blight of Eucalyptus spp.

A análise de sequências de transcriptase reversa (RT) é uma etapa importante para descobrir a presença de elementos transponíveis e investigar o seu papel na geração de variabilidade genética em C. perniciosa. Seqüências putativas de TR foram analisadas no genoma do fitopatógeno C. perniciosa, o agente causal da doença vassoura-de-bruxa no cacau. Um fragmento de 394 pb foi amplificado a partir do DNA genômico de diferentes isolados de C. perniciosa, pertencentes aos biótipos C, L e S e a distintas áreas geográficas. A clivagem dos produtos de PCR com diferentes enzimas de restrição e sequenciamento de vários fragmentos de TR indicou a presença de diferentes seqüências mostrando eventos de transição G:C para A:T. A análise por hibridização revelou alto número de sinais sugerindo a presença de cópias de TR com diferentes perfis entre os isolados dos biótipos C, S e L. As comparações de seqüências dos peptídeos preditos indicam uma relação próxima com a proteína TR de retrotransposons-LTR da família gypsy.

Reverse transcriptase (RT) sequence analysis is an important technique used to detect the presence of transposable elements in a genome. Putative RT sequences were analyzed in the genome of the pathogenic fungus C. perniciosa, the causal agent of witches' broom disease of cocoa. A 394 bp fragment was amplified from genomic DNA of different isolates of C. perniciosa belonging to C-, L-, and S-biotypes and collected from various geographical areas. The cleavage of PCR products with restriction enzymes and the sequencing of various RT fragments indicated the presence of several sequences showing transition events (G:C to A:T). Southern blot analysis revealed high copy numbers of RT signals, forming different patterns among C-, S-, and L-biotype isolates. Sequence comparisons of the predicted RT peptide indicate a close relationship with the RT protein from thegypsy family of LTR-retrotransposons. The possible role of these retrotransposons in generating genetic variability in the homothallic C. perniciosa is discussed.